Comparison of efficiency of various DNA extraction methods from cysts of Giardia intestinalis measured by PCR and TaqMan Real Time PCR

The aim of the presented study was to work out an effective method of extraction of DNA from Giardia intestinalis cysts as well as a sensitive and specific method for detection of DNA of this protozoan using a polymerase chain reaction (PCR). Twelve protocols for DNA extraction have been compared. Purification and extraction of DNA were preceded by additional actions in order to destroy the cysts’ wall. The highest effectiveness of DNA extraction was obtained in case of alternating application of freezing the samples in liquid nitrogen and their incubation in water bath in the temperature of 100 ˚C, and then the extraction with the QIAamp DNA Tissue Mini Kit (QIAGEN) – T kit – with an all night long incubation with proteinase K in 56 ˚C. Effectiveness of DNA extraction with the use of each kit after extraction with each treatment was measured by nested PCR product of β-giardin gene fragment and CT values of real time PCR of the SSU rRNA gene of G. intestinalis. The detection limit, defined as the lowest number detected in 100 % cases, was 100 cysts per 200 μl when effectiveness was evaluated with nested PCR and 50 oocysts with real time PCR after extraction DNA with T kit. Results of our comparative studies have shown that all stages preceding the molecular detection of G. intestinalis DNA are equally important, and materially influence on the final effect and this version of method seems to be very useful for the sensitive detection of DNA of G. intestinalis.

Le but de la présente étude est de proposer une méthode d’extraction d’ADN efficace à partir des kystes de Giardia intestinalis et une méthode de détection, à la fois sensible et spécifique, de l’ADN de ce protozaire par PCR. Douze protocoles d’extraction d’ADN ont été comparés. La purification et l’extraction de l’ADN ont été précédées d’étapes visant à détruire la paroi kystique. L’efficacité optimale a été obtenue en alternant la congélation des échantillons dans l’azote liquide et leur incubation dans de l’eau portée à 100 °C, puis par extraction avec le QIAamp DNA Tissue Mini Kit (QIAGEN) – T kit – avec incubation la nuit entière en présence de protéinase K à 56 °C. L’efficacité d’extraction obtenue avec chaque kit, selon chaque traitement, a été estimée par observation de l’amplicon du gène de la β-giardine obtenu par PCR nichée et d’après les valeurs de Ct obtenues par PCR en temps réel avec des amorces amplifiant le gène SSU ARNr de G. intestinalis. La limite de détection, définie d’après le plus faible pourcentage de cas détectés était de 100 kystes pour 200 microlitres. Les résultats de nos études comparatives montrent l’égale importance de toutes les étapes précédant la détection moléculaire de l’ADN de G. intestinalis et leur influence sur la détection finale, et que cette version méthodologique semble très utile pour une détection sensible de l’ADN de G. intestinalis.